جداسازی و تعیین خصوصیت سویه های باکتریایی بومی مقاوم به کروم (vi) در جهت زیست پالایی محیط های آلوده و بررسی مکانیسم مقاومت در آنها

این تحقیق با هدف جداسازی سویه های باکتریایی مقاوم به کروم و امکان سنجی استفاده از آنها در جهت پاکسازی محیط های آلوده به این فلز سرطانزا صورت گرفت. به این منظور نمونه گیری از معادن کروم سبزوار صورت پذیرفت. غربالگری این نمونه ها منجر به جداسازی 20 سویه ی مقاوم به کروم شد. برای شناسایی سویه ها از روش آنالیز مولکولی ژن 16s rdna استفاده شد و سپس این سویه ها در پایگاه ncbi به ثبت رسیدند. از این میان دو سویه به نام های gfcr-6 و ckcr-6a برای ادامه ی تحقیق برگزیده شدند که مقدار mic برای این سویه ها به ترتیب ppm25000 و ppm75000 بدست آمد آنالیز درخت فیلوژنتیکی بدست آمده تشابه بالای این سویه ها را به ترتیب با جنس های .entrobacter sp و alcaligenes sp. نشان داد. ابتدا مکانیسم مقاومت در این سویه ها مورد بررسی قرار گرفت. اسپکتروسکپی ftir نقش گروه های عاملی مختلف موجود بر سطح باکتری همچون گروه های آمین، کربوکسیل و هیدروکسیل را در جذب سطحی کروم، در بعضی از شرایط بکار رفته، نشان داد. از سوی دیگر تکنیک afm نیز تغییر سطح باکتری ها را در اثر جذب کروم تایید کرد. در پایان این بخش فعالیت کرومات ردوکتازی در برخی از شرایط بکار رفته در راستای مطالعات برداشت کروم مورد بررسی قرار گرفت و نتایج نشان داد احیای آنزیمی یکی از مکانیسم های مقاومت در هر دو سویه است. در مرحله ی بعد برداشت یا حذف کروم(vi) توسط این سویه ها مورد مطالعه قرار گرفت. در این راستا در بخش اول حذف کروم در شرایط in vivo مطالعه شد در این بخش نقش پارامترهای مختلف در میزان برداشت کروم بررسی شد. نتایج نشان داد بیشترین برداشت کروم در دمای c°37، ph=7، agitation rate=180 rpm و در حضور %1 گلوکز اتفاق می افتد. در مرحله ی مطالعه ی تاثیر پارامترها بصورت تک متغیره، کارایی حذف ppm50 در زمان 9 ساعت حاصل شد. به منظور بهینه سازی این فرایند از یک طرح ccd متشکل از این چهار پارامتر در پنج سطح استفاده شد. در مدل های بدست آمده ضریب رگرسیون (r) برای سویه های gfcr-6 و ckcr-6a به ترتیب 0.9620 و 0.9626 بدست آمد که قابلیت بالای این مدل ها را در پیش بینی برداشت کروم نشان می دهد. بهینه سازی توانست کارایی برداشت را به میزان 6 برابر یعنی حذف ppm100 در زمان 3 ساعت بهبود ببخشد. در بخش دیگر برداشت کروم در شرایط in vitro، برای حالت ایستا و نفوذ پذیر شده، مورد مطالعه قرار گرفت ابتدا بهترین عامل برای نفوذپذیر کردن سلول ها انتخاب شد سپس سایر پارامترها بررسی شد در رابطه با نقش ph بیشترین برداشت در سویه ی ckcr-6a در ph=3-5 ولی در سویه ی دیگر در ph=6-8 مشاهده شد اما هر دو سویه در دمای c°37 بیشترین برداشت را نشان داد. بیشینه ی برداشت کروم در سویه ی ckcr-6a در 100 rpmولی در سویه ی دیگر 180 rpm اتفاق افتاد. در این بخش دهنده های الکترونی همچون فروکتوز، گلوکز و استات توانست میزان برداشت را به طور قابل توجهی افزایش دهند. میزان برداشت کروم در حضور سایر فلزات هم مورد بررسی قرار گرفت و نتایج نشان داد تنها یون-های فسفات و جیوه می توانند میزان برداشت کروم را کاهش دهند. برای مطالعات آنزیم شناسی این تحقیق سویه ی ckcr-6a انتخاب گردید. نتایج این بخش نشان داد آنزیم کرومات ردوکتاز مربوط به این سویه فعالیت اورانیوم-ردوکتازی نیز دارد علاوه بر این این سویه قادر به بیان آنزیم تلوریت ردوکناز و سلنات ردوکتاز هم می باشد. همه ی این آنزیم ها در شرایط دمای c°37، ph=6-8 در زمان 24 ساعت و حضور یک درصد گلوکز بیشترین تولید را داشتند. در پایان سلول ها با استفاده از اولتراسونیکاسیون لیز شده و عصاره ی سلولی حاصل جدا شد. تخلیص آنزیم-ها با استفاده از دستگاه fplc و در سه مرحه با کمک ستون هایq-sepharose، phenyl –sepharose و نیز ژل فیلتراسیون با کمک ستون g-100 صورت گرفت.